小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)ELISA試劑盒使用說明書
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EK-Bioscience
Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzyme research
This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis!
（本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷！）
小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)酶聯免疫分析試劑盒
Mouse(D-LDH)ELISA Kit
CAS.NO:Ek-M20042
聲明：尊敬的(de)客戶，感謝您選用本公司的(de)産品。本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中D 乳酸脫氫酶(D-LDH)含量。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分！如(rú)有疑問，請及時聯系我們。
實驗原理(lǐ)
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定标本中小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)水平。用純化的(de)小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)抗體包被微孔闆，制成固相抗體，往包被單抗的(de)微孔中依次加入D 乳酸脫氫酶(D-LDH)，再與HRP 标記的(de)D 乳酸脫氫酶(D-LDH)抗體結合，形成抗體-抗原-酶标抗體複合物，經過徹底洗滌後加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的(de)催化下轉化成藍色，并在酸的(de)作用下轉化成最終的(de)黃色。顔色的(de)深淺和(hé)樣品中的(de)D 乳酸脫氫酶(D-LDH)呈正相關。用酶标儀在450nm 波長(cháng)下測定吸光度（OD 值），通過标準曲線計算樣品中小鼠D 乳酸脫氫酶(D-LDH)濃度。
試劑盒組成：
中文名稱English name 96T/48T 含量保存
ELISA 酶标闆(可(kě)拆卸） Microelisa stripplate 8×12 / 8×6 * 2-8℃
标準品(120ng/L) Standard 1 瓶0.5ml * 2-8℃
标準品稀釋液Standard diluent 1 瓶1.5ml * 2-8℃
酶标試劑HRP-Conjugate reagent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
樣品稀釋液Sample diluent 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
顯色劑A 液Chromogen Solution A 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
顯色劑B 液Chromogen Solution B 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
終止液Stop Solution 1 瓶6 ml/3ml * 2-8℃
濃縮洗滌液wash solution 1 瓶20ml * 2-8℃
說明書Instruction 1 份*
封闆膜Closure plate membrane 2 片*
密封袋Sealed bags 1 個*
标本要求
1. 血清：室溫血液自(zì)然凝固10-20 分鍾後，離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如(rú)有沉澱形成，應再次離(lí)心。
2. 血漿：應根據标本的(de)要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為(wèi)抗凝劑，混合10-20 分鍾後，離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如(rú)有沉澱形成應再次離(lí)心。
3. 尿液：用無菌管收集。離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如(rú)有沉澱形成，應再次離(lí)心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的(de)成份時，用無菌管收集。離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。
5. 培養細胞:檢測細胞內(nèi)的(de)成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml 左右。通過反複凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如(rú)有沉澱形成，應再次離(lí)心。
6. 組織标本:切割标本後，稱取重量。加入一(yī)定量的(de)PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。标本融化後仍然保持2-8℃的(de)溫度。加入一(yī)定量的(de)PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器将标本勻漿化。離(lí)心20 分鍾左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。分裝後一(yī)份待檢測，其餘冷凍備用。
7. 标本采集後盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可(kě)将标本放于-20℃保存，但應避免反複凍融
8.不能檢測含NaN3 的(de)樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(de)（HRP）活性。
試驗所需自(zì)備物品:
1. 酶标儀(450nm 波長(cháng)濾光片)
2. 高(gāo)精度移液器，EP 管及一(yī)次性吸頭
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去(qù)離(lí)子(zǐ)水
4. 吸水紙
操作步驟
1. 标準品的(de)稀釋：本試劑盒提供原倍标準品一(yī)支，用戶可(kě)按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
60ng/L 5 号标準品150μl 的(de)原倍标準品加入150μl 标準品稀釋液
30ng/L 4 号标準品150μl 的(de)5 号标準品加入150μl 标準品稀釋液
15ng/L 3 号标準品150μl 的(de)4 号标準品加入150μl 标準品稀釋液
7.5.ng/L 2 号标準品150μl 的(de)3 号标準品加入150μl 标準品稀釋液
3.75ng/L 1 号标準品150μl 的(de)2 号标準品加入150μl 标準品稀釋液
2. 加樣：分别設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶标試劑，其餘各步操作相同）、标準孔、待測樣品孔。在酶标包被闆上标準品準确加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為(wèi)5 倍)。加樣将樣品加于酶标闆孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封闆膜封闆後置37℃溫育30 分鍾。
4. 配液：将30 倍（48T 的(de)20 倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋後備用
5. 洗滌：小心揭掉封闆膜，棄去(qù)液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒後棄去(qù)，如(rú)此重複5 次，拍幹。
6. 加酶：每孔加入酶标試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：用封闆膜封闆後置37℃溫育30 分鍾。
8. 洗滌：小心揭掉封闆膜，棄去(qù)液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒後棄去(qù)，如(rú)此重複5 次，拍幹。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10 分鍾.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm 波長(cháng)依序測量各孔的(de)吸光度（OD 值）。測定應在加終止液後15 分鍾以內(nèi)進行。
計算
以标準物的(de)濃度為(wèi)橫坐标，OD 值為(wèi)縱坐标，在坐标紙上繪出标準曲線，根據樣品的(de)OD 值由标準曲線查出相應的(de)濃度；再乘以稀釋倍數；或用标準物的(de)濃度與OD 值計算出标準曲線的(de)直線回歸方程式，将樣品的(de)OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wèi)樣品的(de)實際濃度。
注意事項
1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鍾後方可(kě)使用，酶标包被闆開封後如(rú)未用完，闆條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可(kě)能會有結晶析出，稀釋時可(kě)在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準确性，以避免試驗誤差。一(yī)次加樣時間最好控制在5 分鍾內(nèi)，如(rú)标本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的(de)同時做(zuò)标準曲線，最好做(zuò)複孔。如(rú)标本中待測物質含量過高(gāo)（樣本OD 值大于标準品孔第一(yī)孔的(de)OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一(yī)定倍數（n 倍）後再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封闆膜隻限一(yī)次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的(de)操作進行，試驗結果判定必須以酶标儀讀數為(wèi)準.
8．所有樣品，洗滌液和(hé)各種廢棄物都應按傳染物處理(lǐ)。
9．本試劑不同批号組分不得混用。
實驗目的(de)、靈敏度、檢測範圍和(hé)重複性:
●實驗目的(de)：測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中D 乳酸脫氫酶(D-LDH)含量。
●靈敏度：最小可(kě)測0.9ng/L。
●檢測範圍1.5ng/L - 70ng/L。
●重複性：闆內(nèi)，闆間變異系數均<10%。
問題分析
若實驗效果不好，請及時對顯色結果拍照，保留所用闆條及未使用試劑，并妥善保存，然後聯系我公司技術支持為(wèi)您解決問題。同時您也可(kě)以參考以下資料：
問題描述可(kě)能原因相應對策
标準曲線梯
度差
吸液或加液不準檢查移液器及吸頭
标準品稀釋不正确溶解标準品稍微旋轉瓶身，輕輕混勻使粉末完全溶解
洗滌不完全保證洗滌時間和(hé)洗滌次數及每孔的(de)加液量
顯色很弱或
無色
孵育時間太短(duǎn)保證充足的(de)孵育時間
實驗溫度不正确使用推薦的(de)實驗溫度
試劑體積不夠或漏加檢查吸液及加液過程，保證所有試劑按順序足量添加
稀釋不正确
讀數數值低(dī)酶标儀設置不正确在酶标儀上檢查波長(cháng)及濾光片設置
提前打開酶标儀預熱
變異系數大加液不正确檢查加液情況
背景值高(gāo)
檢測抗體的(de)工作濃度使用推薦的(de)稀釋倍數
酶标闆洗滌不完全重新閱讀操作手冊，保證清洗完全；如(rú)果用自(zì)動洗闆
機，請檢查所有的(de)出口是否有堵塞
洗液有污染配制新鮮的(de)洗液
靈敏度低(dī)ELISA 試劑盒保存按說明書要求保存相關試劑
讀數前未終止OD 讀數前應在每孔中加入終止液
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