1.從室溫平衡60min後的(de)鋁箔袋中取出所需闆條，剩餘闆條用自(zì)封袋密封放回4℃。

2.設置标準品孔和(hé)樣本孔，标準品孔各加不同濃度的(de)标準品50μL。

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。樣本不足，或者樣本濃度過高(gāo)，可(kě)用樣本稀釋液做(zuò)稀釋。

4.除空白孔外，标準品孔和(hé)樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）标記的(de)檢測抗體100μL，用封闆膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去(qù)液體，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去(qù)洗滌液，吸水紙上拍幹，如(rú)此重複洗闆5次（也可(kě)用洗闆機洗闆)。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(cháng)處測定各孔的(de)OD值。

1.血清：将收集于血清分離(lí)管的(de)全血标本在室溫放置2小時或4℃過夜，然後1000×g離(lí)心20 分鍾，取上清即可(kě)，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

2.血漿：用EDTA或肝素作為(wèi)抗凝劑采集标本，并将标本在采集後的(de)30分鍾內(nèi)于2-8℃ 1000×g離(lí)心15分鍾，取上清即可(kě)檢測，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

3.組織勻漿：用預冷的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去(qù)除殘留血液（勻漿中裂解的(de)紅(hóng)細胞會影響測量結果），稱重後将組織剪碎。将剪碎的(de)組織與對應體積的(de)PBS（一(yī)般按1:9的(de)重量體積比，比如(rú)1g的(de)組織樣品對應9mL的(de)PBS，具體體積可(kě)根據實驗需要适當調整，并做(zuò)好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為(wèi)了進一(yī)步裂解組織細胞，可(kě)以對勻漿液進行超聲破碎，或反複凍融。最後将勻漿液于5000×g離(lí)心5~10分鍾，取上清檢測。

4.細胞培養上清：請1000×g離(lí)心20分鍾，取上清即可(kě)檢測，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。

5.其他生物樣本：1000×g離(lí)心20分鍾，取上清即可(kě)檢測。

6.樣本外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離(lí)心去(qù)除。

7.樣本保存：樣品收集後若在1周內(nèi)進行檢測的(de)可(kě)保存于4℃，若不能及時檢測，請按一(yī)次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反複凍融，标本溶血會影響最後檢測結果，因此溶血标本不宜進行此項檢測。